навіны

За апошняе дзесяцігоддзе тэхналогія секвенавання генаў шырока выкарыстоўваецца ў даследаваннях раку і клінічнай практыцы, стаўшы важным інструментам для выяўлення малекулярных характарыстык раку. Дасягненні ў малекулярнай дыягностыцы і таргетнай тэрапіі спрыялі развіццю канцэпцый дакладнай тэрапіі пухлін і прынеслі значныя змены ва ўсю сферу дыягностыкі і лячэння пухлін. Генетычнае тэставанне можа быць выкарыстана для папярэджання рызыкі раку, кіравання рашэннямі аб лячэнні і ацэнкі прагнозу, а таксама з'яўляецца важным інструментам для паляпшэння клінічных вынікаў пацыентаў. Тут мы коратка апісваем нядаўнія артыкулы, апублікаваныя ў CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol і іншых часопісах, каб разгледзець прымяненне генетычнага тэставання ў дыягностыцы і лячэнні раку.

Саматычныя мутацыі і мутацыі палавых ліній. У цэлым, рак выклікаецца мутацыямі ДНК, якія могуць быць успадкаваны ад бацькоў (мутацыі палавых ліній) або набыты з узростам (саматычныя мутацыі). Мутацыі палавых ліній прысутнічаюць ад нараджэння, і мутатор звычайна нясе мутацыю ў ДНК кожнай клеткі арганізма і можа перадавацца нашчадкам. Саматычныя мутацыі набываюцца асобінамі ў негаметычных клетках і звычайна не перадаюцца нашчадкам. Як палавыя, так і саматычныя мутацыі могуць разбурыць нармальную функцыянальную актыўнасць клетак і прывесці да злаякаснай трансфармацыі клетак. Саматычныя мутацыі з'яўляюцца ключавым фактарам злаякасных новаўтварэнняў і найбольш прагназуемым біямаркерам у анкалогіі; аднак прыблізна ад 10 да 20 працэнтаў пацыентаў з пухлінамі маюць мутацыі палавых ліній, якія значна павялічваюць рызыку раку, і некаторыя з гэтых мутацый таксама з'яўляюцца тэрапеўтычнымі.
Мутацыя-кіроўца і мутацыя-пасажыр. Не ўсе варыянты ДНК уплываюць на функцыю клеткі; у сярэднім патрабуецца ад пяці да дзесяці геномных падзей, вядомых як «мутацыі-кіроўцы», каб выклікаць нармальную дэгенерацыю клеткі. Мутацыі-кіроўцы часта ўзнікаюць у генах, цесна звязаных з жыццёвымі працэсамі клеткі, такіх як гены, якія ўдзельнічаюць у рэгуляцыі росту клетак, рамонце ДНК, кантролі клеткавага цыклу і іншых жыццёвых працэсах, і маюць патэнцыял для выкарыстання ў якасці тэрапеўтычных мішэняў. Аднак агульная колькасць мутацый у любым раку даволі вялікая і вагаецца ад некалькіх тысяч у некаторых відах раку малочнай залозы да больш чым 100 000 у некаторых высокаварыябельных відах раку каларэктальнага і эндаметрыя. Большасць мутацый не маюць або маюць абмежаванае біялагічнае значэнне, нават калі мутацыя адбываецца ў кадуючай вобласці, такія нязначныя мутацыйныя падзеі называюцца «мутацыямі-пасажырамі». Калі варыянт гена ў пэўным тыпе пухліны прадказвае яе рэакцыю на лячэнне або рэзістэнтнасць да яго, варыянт лічыцца клінічна аперабельным.
Анкагены і гены-супрэсары пухлін. Гены, якія часта мутуюць пры раку, можна ўмоўна падзяліць на дзве катэгорыі: анкагены і гены-супрэсары пухлін. У нармальных клетках бялок, закадзіраваны анкагенамі, у асноўным адыгрывае ролю садзейнічання праліферацыі клетак і інгібіравання апоптозу клетак, у той час як бялок, закадзіраваны генамі-супрэсарамі, у асноўным адказвае за негатыўную рэгуляцыю дзялення клетак для падтрымання нармальнай функцыі клетак. У працэсе злаякаснай трансфармацыі геномная мутацыя прыводзіць да павышэння актыўнасці анкагенаў і зніжэння або страты актыўнасці генаў-супрэсараў.
Невялікія варыяцыі і структурныя варыяцыі. Гэта два асноўныя тыпы мутацый у геноме. Невялікія варыянты змяняюць ДНК, змяняючы, выдаляючы або дадаючы невялікую колькасць асноў, у тым ліку ўстаўляючы аснову, выдаляючы, зрушваючы рамку зчытвання, губляючы стартавыя кадоны, губляючы стоп-кадоны і г.д. Структурныя варыяцыі — гэта вялікая перабудова геному, якая ўключае сегменты генаў памерам ад некалькіх тысяч асноў да большай часткі храмасомы, у тым ліку змены колькасці копій генаў, выдаляючы храмасомы, дуплікацыі, інверсіі або транслакацыі. Гэтыя мутацыі могуць выклікаць зніжэнне або ўзмацненне функцыі бялку. Акрамя змен на ўзроўні асобных генаў, геномныя сігнатуры таксама з'яўляюцца часткай клінічных справаздач аб секвенаванні. Геномныя сігнатуры можна разглядаць як складаныя заканамернасці невялікіх і/або структурных варыяцый, у тым ліку пухлінную мутацыю (TMB), мікрасатэлітную нестабільнасць (MSI) і дэфекты гамалагічных рэкамбінацый.

Кланальныя мутацыі і субклональныя мутацыі. Кланальныя мутацыі прысутнічаюць ва ўсіх пухлінных клетках, прысутнічаюць пры дыягностыцы і застаюцца пасля праходжання лячэння. Такім чынам, клональныя мутацыі могуць быць выкарыстаны ў якасці тэрапеўтычных мішэняў для лячэння пухлін. Субклональныя мутацыі прысутнічаюць толькі ў падгрупе ракавых клетак і могуць быць выяўлены на пачатку дыягностыкі, але знікаюць з наступным рэцыдывам або з'яўляюцца толькі пасля лячэння. Гетэрагеннасць раку адносіцца да наяўнасці некалькіх субклональных мутацый у адным раку. Варта адзначыць, што пераважная большасць клінічна значных драйверных мутацый ва ўсіх распаўсюджаных відах раку з'яўляюцца клональнымі мутацыямі і застаюцца стабільнымі на працягу ўсяго прагрэсавання раку. Рэзістэнтнасць, якая часта апасродкавана субклонамі, можа не выяўляцца пры дыягностыцы, але з'яўляецца, калі рэцыдыў узнікае пасля лячэння.

Традыцыйны метад FISH або карыятыпаванне клетак выкарыстоўваецца для выяўлення змяненняў на храмасомным узроўні. FISH можа быць выкарыстаны для выяўлення зліццяў, дэлецый і ампліфікацый генаў і лічыцца «залатым стандартам» для выяўлення такіх варыянтаў, з высокай дакладнасцю і адчувальнасцю, але абмежаванай прапускной здольнасцю. Пры некаторых гематалагічных злаякасных захворваннях, асабліва пры вострым лейкозе, карыятыпаванне ўсё яшчэ выкарыстоўваецца для дыягностыкі і прагнозу, але гэты метад паступова замяняецца мэтанакіраванымі малекулярнымі аналізамі, такімі як FISH, WGS і NGS.
Змены ў асобных генах можна выявіць з дапамогай ПЛР, як у рэжыме рэальнага часу, так і ў лічбавай кропельнай ПЛР. Гэтыя метады маюць высокую адчувальнасць, асабліва падыходзяць для выяўлення і маніторынгу невялікіх рэшткавых паражэнняў і дазваляюць атрымаць вынікі за адносна кароткі час. Недахопам з'яўляецца абмежаваны дыяпазон выяўлення (звычайна выяўляюць мутацыі толькі ў адным або некалькіх генах), а таксама абмежаваная магчымасць правядзення некалькіх тэстаў.
Імунагістахімія (ІГХ) — гэта інструмент маніторынгу на аснове бялкоў, які звычайна выкарыстоўваецца для выяўлення экспрэсіі біямаркераў, такіх як ERBB2 (HER2) і рэцэптары эстрагена. ІГХ таксама можа быць выкарыстана для выяўлення спецыфічных мутаваных бялкоў (напрыклад, BRAF V600E) і спецыфічных зліццяў генаў (напрыклад, зліццяў ALK). Перавага ІГХ заключаецца ў тым, што яе можна лёгка інтэграваць у звычайны працэс аналізу тканін, таму яе можна спалучаць з іншымі тэстамі. Акрамя таго, ІГХ можа даць інфармацыю аб субклеткавай лакалізацыі бялкоў. Недахопамі з'яўляюцца абмежаваная маштабаванасць і высокія арганізацыйныя патрабаванні.
Секвенаванне другога пакалення (NGS) NGS выкарыстоўвае высокапрадукцыйныя метады паралельнага секвенавання для выяўлення варыяцый на ўзроўні ДНК і/або РНК. Гэты метад можа быць выкарыстаны для секвенавання як усяго геному (WGS), так і цікавячых генных абласцей. WGS дае найбольш поўную інфармацыю аб геномных мутацыях, але існуе шмат перашкод для яго клінічнага прымянення, у тым ліку неабходнасць свежых узораў пухліннай тканіны (WGS пакуль не падыходзіць для аналізу ўзораў, імабілізаваных у фармаліне) і высокі кошт.
Мэтавае секвенаванне NGS уключае секвенаванне ўсяго экзона і панэль мэтавых генаў. Гэтыя тэсты ўзбагачаюць цікавыя вобласці ДНК-зондамі або ПЛР-ампліфікацыяй, тым самым абмяжоўваючы аб'ём неабходнага секвенавання (увесь экзон складае ад 1 да 2 працэнтаў геному, і нават вялікія панэлі, якія змяшчаюць 500 генаў, складаюць толькі 0,1 працэнта геному). Нягледзячы на ​​тое, што секвенаванне ўсяго экзона добра працуе ў фіксаваных фармалінам тканінах, яго кошт застаецца высокім. Камбінацыі мэтавых генаў адносна эканамічныя і дазваляюць гнуткасць у выбары генаў для тэставання. Акрамя таго, цыркулюючая свабодная ДНК (cfDNA) з'яўляецца новым варыянтам геномнага аналізу хворых на рак, вядомым як вадкія біяпсіі. Як ракавыя клеткі, так і нармальныя клеткі могуць вызваляць ДНК у кроў, і ДНК, якая вылучаецца з ракавых клетак, называецца цыркулюючай пухліннай ДНК (ctDNA), якую можна прааналізаваць для выяўлення патэнцыйных мутацый у пухлінных клетках.
Выбар тэсту залежыць ад канкрэтнай клінічнай праблемы, якую трэба вырашыць. Большасць біямаркераў, звязаных з зацверджанымі метадамі лячэння, можна выявіць з дапамогай метадаў FISH, IHC і ПЛР. Гэтыя метады з'яўляюцца разумнымі для выяўлення невялікай колькасці біямаркераў, але яны не паляпшаюць эфектыўнасць выяўлення з павелічэннем прапускной здольнасці, і калі выяўлена занадта шмат біямаркераў, можа не хапіць тканіны для выяўлення. Пры некаторых канкрэтных відах раку, такіх як рак лёгкіх, дзе ўзоры тканін цяжка атрымаць і ёсць некалькі біямаркераў для тэставання, выкарыстанне NGS з'яўляецца лепшым выбарам. У заключэнне, выбар аналізу залежыць ад колькасці біямаркераў, якія трэба праверыць для кожнага пацыента, і колькасці пацыентаў, якіх трэба праверыць на біямаркер. У некаторых выпадках дастаткова выкарыстання IHC/FISH, асабліва калі мішэнь вызначана, напрыклад, выяўленне рэцэптараў эстрагену, рэцэптараў прогестэрону і ERBB2 у пацыентаў з ракам малочнай залозы. Калі патрабуецца больш поўнае даследаванне геномных мутацый і пошук патэнцыйных тэрапеўтычных мішэняў, NGS з'яўляецца больш арганізаваным і эканамічна эфектыўным. Акрамя таго, NGS можа быць разгледжаны ў выпадках, калі вынікі IHC/FISH неадназначныя або непераканаўчыя.

Розныя рэкамендацыі даюць рэкамендацыі адносна таго, якія пацыенты павінны мець права на генетычнае тэставанне. У 2020 годзе Рабочая група ESMO па дакладнай медыцыне апублікавала першыя рэкамендацыі па тэсціраванні NGS для пацыентаў з запушчаным ракам, рэкамендуючы руціннае тэсціраванне NGS для запушчаных неплоскаклеткавых немелкоклетачных узораў рака лёгкіх, рака прастаты, каларэктнага рака, рака жоўцевых праток і рака яечнікаў, а ў 2024 годзе ESMO абнавіла гэтую інфармацыю, рэкамендуючы ўключыць рак малочнай залозы і рэдкія пухліны, такія як страмальныя пухліны страўнікава-кішачнага гасцінца, саркомы, рак шчытападобнай залозы і рак невядомага паходжання.
У 2022 годзе ў клінічным заключэнні ASCO адносна саматычнага геномнага тэставання ў пацыентаў з метастатычным або запушчаным ракам гаворыцца, што калі тэрапія, звязаная з біямаркерамі, ухвалена ў пацыентаў з метастатычнымі або запушчанымі цвёрдымі пухлінамі, для гэтых пацыентаў рэкамендуецца генетычнае тэставанне. Напрыклад, геномнае тэставанне варта праводзіць пацыентам з метастатычнай меланомай для скрынінга мутацый BRAF V600E, паколькі інгібітары RAF і MEK ухвалены для гэтага паказання. Акрамя таго, генетычнае тэставанне варта праводзіць і пры наяўнасці выразнага маркера рэзістэнтнасці да прэпарата, які будзе прызначацца пацыенту. Напрыклад, эгфрмаб неэфектыўны пры каларэктальным раку з мутацыяй KRAS. Пры разглядзе прыдатнасці пацыента для секвенавання генаў неабходна ўлічваць яго фізічны стан, сумежныя захворванні і стадыю пухліны, паколькі шэраг этапаў, неабходных для секвенавання геному, уключаючы згоду пацыента, лабараторную апрацоўку і аналіз вынікаў секвенавання, патрабуе ад пацыента дастатковай фізічнай працаздольнасці і працягласці жыцця.
Акрамя саматычных мутацый, некаторыя віды раку павінны быць пратэставаны на наяўнасць генаў зародкавай лініі. Тэставанне на мутацыі зародкавай лініі можа паўплываць на рашэнні аб лячэнні такіх відаў раку, як мутацыі BRCA1 і BRCA2 пры раку малочнай залозы, яечнікаў, прастаты і падстраўнікавай залозы. Мутацыі зародкавай лініі таксама могуць мець значэнне для будучага скрынінгу і прафілактыкі раку ў пацыентаў. Пацыенты, якія патэнцыйна падыходзяць для тэставання на мутацыі зародкавай лініі, павінны адпавядаць пэўным умовам, якія ўключаюць такія фактары, як сямейны анамнез раку, узрост на момант пастаноўкі дыягназу і тып раку. Аднак многія пацыенты (да 50%), якія маюць патагенныя мутацыі ў зародкавай лініі, не адпавядаюць традыцыйным крытэрыям для тэставання на мутацыі зародкавай лініі, заснаваныя на сямейным анамнезе. Такім чынам, каб максімальна ідэнтыфікаваць носьбітаў мутацый, Нацыянальная комплексная сетка па барацьбе з ракам (NCCN) рэкамендуе, каб усе або большасць пацыентаў з ракам малочнай залозы, яечнікаў, эндаметрыя, падстраўнікавай залозы, каларэктальнага рака або прастаты прайшлі тэставанне на мутацыі зародкавай лініі.
Што тычыцца часу генетычнага тэсціравання, паколькі пераважная большасць клінічна значных драйверных мутацый з'яўляюцца клональнымі і адносна стабільнымі на працягу прагрэсавання раку, мэтазгодна праводзіць генетычнае тэсціраванне пацыентаў у момант дыягностыкі запушчанага раку. Для наступнага генетычнага тэсціравання, асабліва пасля малекулярна-таргетнай тэрапіі, тэставанне цтДНК мае больш пераваг, чым ДНК пухліннай тканіны, паколькі ДНК крыві можа ўтрымліваць ДНК з усіх пухлінных паражэнняў, што больш спрыяе атрыманню інфармацыі аб гетэрагеннасці пухліны.
Аналіз цтДНК пасля лячэння можа прадказаць рэакцыю пухліны на лячэнне і вызначыць прагрэсаванне захворвання раней, чым стандартныя метады візуалізацыі. Аднак пратаколы выкарыстання гэтых дадзеных для прыняцця рашэнняў аб лячэнні не былі распрацаваны, і аналіз цтДНК не рэкамендуецца, за выключэннем выпадкаў, калі праводзяцца клінічныя выпрабаванні. цтДНК таксама можа быць выкарыстана для ацэнкі невялікіх рэшткавых паражэнняў пасля радыкальнай аперацыі па выдаленні пухліны. Тэставанне цтДНК пасля аперацыі з'яўляецца моцным прагнастычным фактарам наступнага прагрэсавання захворвання і можа дапамагчы вызначыць, ці будзе пацыент карысным ад ад'ювантнай хіміятэрапіі, але ўсё ж не рэкамендуецца выкарыстоўваць цтДНК па-за клінічнымі выпрабаваннямі для прыняцця рашэнняў аб ад'ювантнай хіміятэрапіі.

Апрацоўка дадзеных Першым крокам у секвенаванні геному з'яўляецца вылучэнне ДНК з узораў пацыентаў, падрыхтоўка бібліятэк і стварэнне неапрацаваных дадзеных секвенавання. Неапрацаваныя дадзеныя патрабуюць далейшай апрацоўкі, у тым ліку фільтрацыі нізкаякасных дадзеных, параўнання іх з эталонным геномам, ідэнтыфікацыі розных тыпаў мутацый з дапамогай розных аналітычных алгарытмаў, вызначэння ўплыву гэтых мутацый на трансляцыю бялку і фільтрацыі мутацый палавай лініі.
Анатацыя гена-кіроўцы прызначана для адрознення мутацый кіроўцы і пасажыра. Мутацыі кіроўцы прыводзяць да страты або ўзмацнення актыўнасці гена-супрэсара пухліны. Невялікія варыянты, якія прыводзяць да інактывацыі генаў-супрэсараў пухліны, уключаюць нонсэнс-мутацыі, мутацыі зруху рамкі зчытвання і мутацыі ключавых сайтаў сплайсінгу, а таксама радзейшыя дэлецыі стартавых кодонаў, дэлецыі стоп-кодонаў і шырокі спектр мутацый устаўкі/дэлецыі інтронаў. Акрамя таго, міссэнс-мутацыі і невялікія мутацыі ўстаўкі/дэлецыі інтронаў таксама могуць прывесці да страты актыўнасці гена-супрэсара пухліны пры ўздзеянні на важныя функцыянальныя дамены. Структурныя варыянты, якія прыводзяць да страты актыўнасці гена-супрэсара пухліны, уключаюць частковую або поўную дэлецыю генаў і іншыя геномныя варыянты, якія прыводзяць да разбурэння рамкі зчытвання генаў. Невялікія варыянты, якія прыводзяць да ўзмацнення функцыі анкагенаў, уключаюць міссэнс-мутацыі і выпадковыя ўстаўкі/дэлецыі інтронаў, якія накіраваны на важныя функцыянальныя дамены бялкоў. У рэдкіх выпадках усячэнне бялку або мутацыі сайта сплайсінгу могуць прывесці да актывацыі анкагенаў. Структурныя варыяцыі, якія прыводзяць да актывацыі анкагенаў, уключаюць зліццё генаў, дэлецыю генаў і дуплікацыю генаў.
Клінічная інтэрпрэтацыя геномных змен ацэньвае клінічную значнасць выяўленых мутацый, г.зн. іх патэнцыйную дыягнастычную, прагнастычную або тэрапеўтычную каштоўнасць. Існуе некалькі сістэм класіфікацыі, заснаваных на доказах, якія можна выкарыстоўваць для кіраўніцтва клінічнай інтэрпрэтацыяй геномных змен.
У базе дадзеных па дакладнай медыцыне анкалагічнага цэнтра Мемарыяльнага анкалагічнага цэнтра імя Слоуна-Кетэрынга (OncoKB) варыянты генаў класіфікуюцца на чатыры ўзроўні ў залежнасці ад іх прагнастычнай каштоўнасці для выкарыстання лекаў: 1/2 узровень — зацверджаныя FDA або клінічна стандартныя біямаркеры, якія прадказваюць рэакцыю на зацверджаны прэпарат па пэўных паказаннях; 3 узровень — зацверджаныя FDA або не зацверджаныя біямаркеры, якія прадказваюць рэакцыю на новыя таргетныя прэпараты, якія паказалі сябе перспектыўнымі ў клінічных выпрабаваннях, і 4 узровень — не зацверджаныя FDA біямаркеры, якія прадказваюць рэакцыю на новыя таргетныя прэпараты, якія паказалі пераканаўчыя біялагічныя доказы ў клінічных выпрабаваннях. Была дададзена пятая падгрупа, звязаная з рэзістэнтнасцю да лячэння.
У рэкамендацыях Амерыканскага таварыства малекулярнай паталогіі (AMP)/Амерыканскага таварыства клінічнай анкалогіі (ASCO)/Каледжа амерыканскіх паталагаанатамаў (CAP) па інтэрпрэтацыі саматычных варыяцый саматычныя варыяцыі падзяляюцца на чатыры катэгорыі: I ступень — з моцным клінічным значэннем; II ступень — з патэнцыйным клінічным значэннем; III ступень — клінічнае значэнне невядомае; IV ступень — клінічнае значэнне невядомае. Толькі варыянты I і II ступені маюць каштоўнасць для прыняцця рашэнняў аб лячэнні.
Шкала клінічнай аперабельнасці малекулярных мішэняў ESMO (ESCAT) класіфікуе варыянты генаў на шэсць узроўняў: I узровень — мішэні, прыдатныя для руціннага выкарыстання; II фаза — мішэнь, якая ўсё яшчэ вывучаецца, верагодна, будзе выкарыстоўвацца для скрынінга папуляцыі пацыентаў, якія маглі б атрымаць карысць ад мэтавага прэпарата, але для яго пацверджання патрэбныя дадатковыя дадзеныя; III ступень — мэтавыя варыянты генаў, якія прадэманстравалі клінічную карысць пры іншых відах раку; IV ступень — толькі мэтавыя варыянты генаў, пацверджаныя даклінічнымі дадзенымі; V ступень — ёсць доказы, якія пацвярджаюць клінічную значнасць мэтавай тэрапіі мутацыі, але тэрапія адным прэпаратам супраць мішэні не падаўжае выжывальнасць, альбо можа быць прынята камбінаваная стратэгія лячэння; X ступень — адсутнасць клінічнай каштоўнасці.